Thèse Année : 2023

Contribution of genomics in multidrug-resistant tuberculosis : from studying the molecular basis of dissemination to the discovery of new resistance mechanisms

Apport de la génomique dans la tuberculose multirésistante : de l’étude des bases moléculaires de la dissémination à la découverte de nouveaux mécanismes de résistance

Résumé

Background: Tuberculosis (TB) remains one of the leading causes of death worldwide. The spread of multidrug-resistant (MDR) strains is alarming. Second-line drugs classified in WHO group A (fluoroquinolones (FQ), bedaquiline (BDQ) and linezolid) are the key drugs. Unfortunately, recent years have seen the emergence of extensively drug-resistant (XDR) strains that are MDR and resistant to FQ and one of the other group A drugs. Controlling the emergence and spread of these resistant forms relies on: (i) early and effective treatment of patients; it is thus essential to diagnose resistance to anti-tuberculosis drugs (anti-TB) as well as possible, by optimizing molecular diagnosis and (ii) understanding the mechanisms of dissemination of MDR strains. This work responds to these challenges by a genomic approach, with the following objectives: to improve the diagnosis of FQ resistance (axis 1), and to investigate the molecular mechanisms of dissemination of a particular cluster of MDR strains (axis 2). Beyond the experimental work necessary to achieve these objectives, works and publications related to the context of the subject and allowing me to understand my thesis project have been realized. These publications cited in the bibliographic part of this thesis manuscript (articles 1 to 6), will not be detailed here. Axis 1: we investigated the molecular mechanisms of resistance to FQ not related to mutations in the DNA gyrase. We analyzed the genomes of nearly 1500 FQ-resistant M. tuberculosis (Mtb) strains without DNA gyrase mutations, both clinical strains (database of the CNR des Mycobactéries and CRyPTIC consortium) and strains selected in vivo (TB mouse model). The genomic analysis revealed: (i) the putative role of the mfpAE operon, and (ii) a novel mechanism in Mtb, namely the presence of massive genomic duplications containing this operon. These in silico hypotheses were then explored by an experimental approach. Axis 2: Among the strains collected at the CNR over the last 20 years, an MDR cluster of lineage 4 was distinguished by a specific combination of resistance mutations: KatG-A110V and EthA-Q269*; strains with few gap mutations (< 8), although isolated over a period of 20 years, testifying to a low evolutionary speed. We explored the molecular characteristics of this cluster, particularly in terms of virulence to explain this persistence. Genomic analysis revealed a specific mutation in ESX-1, a key element of virulence in Mtb, upstream of espK. To explore the hypothesis of the localization of this mutation within the espK promoter, we performed (i) an in-silico promoter prediction study and (ii) qPCR experiments to assess the impact of this mutation on the transcription of espK, but also of esxA, which encodes the virulence factor ESAT-6. We showed that there would be an inverse correlation between the level of transcription of espK and esxA. Conclusion: this work has allowed (i) to improve the knowledge on FQ resistance, and (ii) to better understand the molecular basis of the persistence of an MDR cluster linked to ESX-1. In the continuity of this work, I will continue the study of the molecular mechanisms involved in the resistance to the new antituberculosis drugs (bedaquiline, delamanid and pretomanid).
Contexte : La tuberculose (TB) demeure une des premières causes de décès à l’échelle mondiale. La dissémination de souches multirésistantes (MDR) est alarmante. Les molécules de 2nde ligne classées dans le groupe A de l’OMS (fluoroquinolones (FQ), bédaquiline (BDQ) et linézolide), sont les molécules clé du traitement. Malheureusement, on assiste ces dernières années à l’émergence de souches ultrarésistantes (XDR) qui sont MDR et résistantes aux FQ et à l’une des autres molécules du groupe A. La lutte contre l’émergence et la dissémination de ces formes résistantes repose sur : (i) le traitement précoce et efficace des patients ; il est ainsi indispensable de diagnostiquer au mieux la résistance aux antituberculeux (antiTB), en optimisant le diagnostic moléculaire et (ii) la compréhension des mécanismes de dissémination des souches MDR. Ce travail répond à ces enjeux avec une approche génomique, par les objectifs suivants : améliorer le diagnostic de la résistance aux FQ (axe 1), et investiguer les mécanismes moléculaires de dissémination d’un cluster particulier de souches MDR (axe 2). Au-delà du travail expérimental nécessaire pour mener à bien ces objectifs, des travaux et publications en lien avec le contexte du sujet et me permettant de bien appréhender mon projet de thèse ont été réalisés. Ces travaux cités dans la partie bibliographique de ce manuscrit de thèse (articles 1 à 6), ne seront pas détaillés ici. Axe 1 : nous avons investigué les mécanismes moléculaires de résistance aux FQ non liés aux mutations dans l’ADN gyrase. Nous avons analysé les génomes de près de 1500 souches de M. tuberculosis (Mtb) résistantes aux FQ sans mutation dans l’ADN gyrase, à la fois de souches cliniques (database du CNR des Mycobactéries et consortium CRyPTIC) et de souches sélectionnées in vivo (modèle murin de TB). L’analyse génomique a mis en évidence : (i) le rôle putatif de l’opéron mfpAE, et (ii) un mécanisme inédit chez Mtb, à savoir la présence de duplications génomiques massives contenant cet opéron. Ces hypothèses in silico ont ensuite été explorées par une approche expérimentale. Axe 2 : Parmi les souches collectées au CNR ces 20 dernières années, un cluster MDR de la lignée 4 se distinguait par une combinaison spécifique de mutations de résistance : KatG-A110V et EthA-Q269* ; les souches ayant peu de mutations d’écart (< 8), bien qu’isolées sur une période de 20 ans, témoignant d’une faible vitesse d’évolution. Nous avons exploré les caractéristiques moléculaires de ce cluster, notamment sur le plan de la virulence pour expliquer cette persistance. L’analyse génomique a mis en évidence une mutation spécifique au niveau d’ESX-1, élément clé de la virulence chez Mtb, en amont d’espK. Afin d’explorer l’hypothèse de la localisation de cette mutation au sein du promoteur d’espK, nous avons réalisé (i) une étude de prédiction du promoteur in silico et (ii) des expériences de qPCR pour évaluer l’impact de cette mutation sur la transcription d’espK, mais aussi d’esxA, qui code le facteur de virulence ESAT-6. Nous avons montré qu’il y aurait une corrélation inverse entre le niveau de transcription d’espK et d’esxA. Conclusion : ce travail de Thèse a ainsi permis (i) d’améliorer les connaissances sur la résistance aux FQ, et (ii) de mieux comprendre les bases moléculaires de la persistance d’un cluster MDR liée à ESX-1. Dans la continuité de ces travaux, je poursuivrai l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance aux nouveaux antituberculeux (bédaquiline, délamanide et prétomanide).
Fichier principal
Vignette du fichier
MOREL_Florence_these_2023.pdf (25 Mo) Télécharger le fichier
Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04924807 , version 1 (01-02-2025)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04924807 , version 1

Citer

Florence Morel. Apport de la génomique dans la tuberculose multirésistante : de l’étude des bases moléculaires de la dissémination à la découverte de nouveaux mécanismes de résistance. Bactériologie. Sorbonne Université, 2023. Français. ⟨NNT : 2023SORUS139⟩. ⟨tel-04924807⟩
0 Consultations
0 Téléchargements

Partager

More